Las Ayudas Serono de Investigación 2004 fueron presididas por S. M. La Reina y otorgadas a 5 proyectos de las siguientes áreas de Investigación: Investigación Clínica en Endocrinología, Reproducción Humana Asistida, Investigación Clínica en Esclerosis Múltiple, Psoriasis: Inmunología y Clínica, Investigaçâo Clínica em Neuroinmunología.

Área de Investigación Clínica en Endocrinología


Proyecto de Investigación:

Determinantes moleculares y genéticos del síndrome metabólico: activación crónica del sistema inmune.

Investigador Principal:

Dr. José Manuel Fernández

Resumen del proyecto:

La diabetes mellitas de tipo 2 es una enfermedad altamente prevalerte (afecta al 5% de la población adulta), con una elevada morbilidad y mortalidad, principalmente cardiovascular, y un alto costo sociosanitario. Fenotípicamente se caracteriza por hiperglucemia y resistencia a la insulina, frecuentemente asociadas a otras alteraciones metabólicas (hipertensión, dislipemia y obesidad central), constituyendo, en conjunto, el denominado síndrome metabólico.

La etiología del síndrome metabólico es poligénica con influencia de factores medioambientales. En este sentido, nuestro equipo ha identificado algunos de los determinantes moleculares y genéticos del síndrome de insulinoresistencia. Siguiendo ésta línea de investigación, el objetivo principal del presente proyecto es la caracterización molecular y genética de nuevos factores moduladores de la sensibilidad a la insulina en una amplia muestra de sujetos sanos, obsesos y diabéticos de tipo 2. Concretamente, se estudiará y caracterizará la presencia de restos de DNA bacteriano en el plasma de sujetos sin patología inflamatoria clínica. Con el fin de analizar la capacidad immunoestimuladora del DNA bacteriano, su relación con los niveles de citocinas y otras moléculas proinflamatorias, y su posible implicación el desarrollo de algunos determinantes clínicos del síndrome metabólico.

La metodología a emplear consistirá en técnicas de PCR a tiempo real para la cuantificación de restos de DNA bacteriano en plasma de los sujetos en estudio, y de secuenciación para su determinación específica. Así mismo, se emplearán técnicas de cultivo celular “ex vivo” para el análisis de la expresión de citocinas en linfocitos periféricos, tanto a nivel de expresión génica mediante amplificación por PCR, como a nivel de cuantificación de los niveles plasmáticos mediante técnicas de análisis de immunoabsorbancia unido a enzima.

Composición del Jurado:

Dr. D. Jesús Argente Oliver, Dr. D. Manuel Jorge Fontoura Pinheiro de Magalhães, Dr. D. Antonio José Monica Silva Guerra, Dr. D. José Luis Lechuga Campoy, Dr. D. Juan Soler Ramón, Dr. D. Antonio Carrascosa

Área de Reproducción Humana Asistida


Proyecto de Investigación:

Función del receptor de leptina en la implantación embrionaria. Implicaciones clínicas en la obesidad e infertilidad.

Investigador Principal:

Dra. Ana Cristina Cervero Sanz

Resumen del proyecto:

El sistema de la leptina está implicado en la regulación del peso corporal y en la función reproductiva actuando a niveles endocrinos y paracrinos. La forma larga del receptor de leptina (OB-RL), así como otras isoformas solubles, han sido identificadas en el endometrio humano, principalmente en el compartimento epitelial. Además su expresión en el endometrio humano muestra una variación cíclica con un aumento de su expresión en la ventana de implantación sugiriendo su posible implicación como marcador de receptividad endometrial. El receptor de leptina está presente a lo largo de todo el desarrollo preimplantatorio en embriones humanos mientras que la leptina únicamente se expresa en estadío de blastocisto. Todo esto sugiere que este sistema podría estar implicado en el diálogo materno-embrionario que se establece guante la implantación embrionaria humana.

Objetivos: 1) Determinar la importancia funcional del receptor de leptina en la implantación embrionaria. 2) Comparar la expresión endometrial del OB-RL y las concentraciones periféricas de leptina en pacientes delgadas (IMC<20) y obesas (IMC>30) de fertilidad probada y con fallo de implantación de origen endometrial. 3) Secuenciar el gen OB-R en pacientes infértiles y/o obesas con ausencia de expresión del mRNA. De esta manera esperamos encontrar posibles mutaciones a nivel génico que expliquen la ausencia de dicha expresión.

Metodología: a) Clonaje de secuencia RNAi en el vector mediante procesos de restricción, ligación y transformación de bacterias. b) PCR cuantitativa. c) Western blot y microscopía confocal. d) Ensayos de ELISA para cuantificar la cantidad de leptina en sangre. e) Cultivos de células endometriales epiteliales (CEE). f) Transfección temporal de las células epiteliales endometriales humanas. g) Ensayos de adhesión in Vitro. h) Secuenciación.

Composición del Jurado:

Dr. D. Guillermo Antiñolo Gil, Dr. D. Joaquín Calaf Alsina, Dr. D. Carlos Calhaz Jorge, Dr. D. Alfonso De la Fuente Hernández, Dra. Dª Esther Fernández García, Dr. D. Eleuterio Hernández Miguel, Dr. D. Federico Galera Fernández, Dr. D. Antonio Requena Mirand, Dr. D. Joao Luis Silva Carvalho

Área de Investigación Clínica en Esclerosis Múltiple


Proyecto de Investigación:

Papel de la síntesis intratecal de IgM en la fisiopatología de la esclerosis múltiple.

Investigador Principal:

Dr. José Carlos Álvarez Cermeño

Resumen del proyecto:

La esclerosis múltiple (EM), es la enfermedad desmielinizante más frecuente. Presenta una fase inicial inflamatoria con evolución recidivante-remitente, donde los síntomas neurológicos deben principalmente a la desmielinización, siendo parcial o totalmente reversibles. Esta fase se sigue de otra progresiva en un gran porcentaje de los pacientes, en donde prevalece una patogenia neurodegenerativa con disfunción y fragmentación axonal, que es la causa de los déficits neurológicos irreversibles. Hemos descrito que la síntesis intratecal de IgM se asocia a la progresión de la EM y es un factor pronóstico de aparición de nuevos brotes y mayor discapacidad. Por ello, se deduce que la IgM se asocia, bien directa o indirectamente, con la lesión axonal y la neurodegeneración.

El propósito de este proyecto es estudiador el papel de la IgM en la fisiopatología de la EM: analizar los posibles autoantígenos contra los que pueda ir dirigida (proteicos, lipídicos, etc.) y estudiar las subpoblaciones B del LCR que la producen. Se pretende además investigar si la progresión de los décicits neurológicos y la atrofia cerebral se correlacionan con la presencia de una determinada población de células B, o un determinado antígeno o grupo de antígenos frente a los que esta respuesta pueda ir dirigida. Además se estudiara el posible uso de los datos como factores pronósticos de incapacidad. Posteriormente, se estudiará el efecto de la IgM aislada de los pacientes sobre cultivos de oligodendrocitos de neuronas murinas fetales con el fin de encontrar un modelo para estudiar los mecanismos de lesión y sus inhibidores.

Composición del Jurado:

Dr. D. João Correira de Sa, Dr. D. Oscar Fernández Fernández, Dr. D. Jorge Matías-Guiu, Dr. D. José María Pereira Monteiro, Dr. D. Alfredo Rodríguez-Antigüedad Zarranz, Dr. D. Angel Sánchez Rodríguez, Dr. D. Augusto Silva González

Área de Investigación Clínica en Psoriasis: Inmunología y Clínica


Proyecto de Investigación:

Patogenia de la psoriasis: estudio del papel de las células T CD4/NKG2C+ y su capacidad para transferir la enfermedad a ratones scid xenotransplantados con biopsias psoriásicas.

Investigador Principal:

Dr. Salvio Serrano Ortega

Resumen del proyecto:

La psoriasis vulgar es una enfermedad inflamatoria de la piel caracterizada por la hiperproliferación de queratinocitos epidérmicos acompañada de intensos infiltrados leucocitarios. En la compleja patogenia de la enfermedad intervienen números factores, entre los que cabe destacar el papel de diversas citoquinas y quiomioquinas, algunos genes que pueden estar relacionados con al susceptibilidad a padecerla y fundamentalmente las células que infiltran la lesión psoriasica. De ellas, las células dendítricas y los linfocitos T parecen ser los elementos esenciales responsables de la inflamación. Se ha sugerido recientemente que psoriasis es una reacción inflamatoria de Tipo 1, esto es, mediada por interferón gamma (IFN) que se produciría en respuesta a la presencia de cantidades excesivas de IL-12 e IL-23 principalmente. Sin embargo, la escasa representación en la lesión de los diferentes receptores para antigeno (TCR) en células T sugiere poderosamente la existencia de un auto o neoantigeno en las zonas delusión soriasica que es reconocido exclusivamente por esos TCR y que permanece sin identificar. Interesantemente, se ha descrito la presencia en los infiltrados de células T CD4+ que expresan también receptores CD94, conocidos por su capacidad para regular positiva o negativamente la producción de IFN tanto en células T citotoxicas como colaboradoras. Nosotros hemos demostrado recientemente que las células T CD4+ expresan también CD94 y que la función de estos receptores es la perpetuación de las respuestas crónicas, mediante la regulación de la producción de IFN, al igual que parece suceder en la psoriasis. Asimismo se ha descrito una línea de células T CD4+CD94+ procedente de una lesión psoriasica que tiene la capacidad de inducir la enfermedad en ratones inmunodeficientes severos (SCID xenoinjertados) de 35 clonos de células T CD4+CD94+ obtenidos por nosotros de biopsias de lesiones psoriasicas de pacientes de nuevo diagnostico y no sometidos a tratamiento antiinflamatorio en el momento de obtención del a muestra.

Composición del Jurado:

Dr. D. José Luis Díaz Pérez, Dr. D. Carlos Ferrándiz Foraster, Dr. D. Amaro García Díez, Dra. Dª María Gabriela Marqués Pinto, Dra. Dª María Sánchez Aguilar-Rojas, Dr. D. Manuel Santamaría Osorio, Dr. D. Jaime Toribio Pérez

Bolsa Serono de Investigaçâo Biomédica en el Área de Investigación Clinica em Neuroinmunología


Proyecto de Investigación:

Identificación de respuestas linfocíticas B y T contra el inhibidor del crecimiento axónico asociado a mielina, Nogo-A, en pacientes con esclerosis múltiple y otras afecciones de la sustancia blanca cerebral.

Investigador Principal:

Dr. Paulo Pacheco da Fontoura

Resumen del proyecto:

A Esclerose Múltipla (EM) é a doença desmielinizante prototípica do Sistema Nervoso Central (CNS) e a principal causa de incapacidade de causa neurológica em adultos jovens, excluindo os traumatismos. A EM caracterieza-se predominante pela ocorrência de episódios periódicos de agravamento clínico coincidentes com o aparecimento de lesôes desmielinizantes em vários locais do CNS; mesmo na ausencia de sintomatología clínica, no en tanto, é reconhecido actualmente que ocorrem vários episódios subclínicos de desmielinizaçâo durante o curso de doença, que por virtude de sua menor gravidade, ou da sua localizaçâo, nâo chegam a ultrapasar o limiar de detecçâo clínica (1). Os mecanismos que determinam a ocorrência destes surtos de desmielinizaçâo nâo sâo conhecidos em profundidade, embora Sejas reconhecidas associaçôes com outros eventos que podem ter influência no Sistema Imune, como Sejas algunas infecçôes. Numa segunda fase da doença, asiste-se ao acumular progresivo de défices neurológicos mesmo na ausencia de episódios de desmielinizaçâo. O reconhecimento relativamente recente da existencia de danos asonáis precoces nas lesôes desmielinizantes agudas (2), gerou o conceito de que a incapacidade nesta fase secundariamente progresiva resulta do acumular progresivo de danos asonáis em múltiplos circuitos neuronais, e que, portante, a EM após um período inicial em que as manifestaçôes clínicas resultam sobretodo da interrupçâo aguda da transmissÇa`axonal em áreas de desmielinizaçâo, se transforma Numa doença neurodegenerativa nas fases tardías, por virtude de perda cumulativa de axónios.

Embora nâo exista um consenso absoluto sobre a fisiopatología da EM, todos os dados actuais apontam no sentido da doença resultar em grande parte da actividade desregulada do Sistema Imune. Por ejemplo, resultados de estudos neuropatológicos das lesôes de EM (3), demostraram que em pelo menos dois dos subtipos fundamentais de lesôes há evidência da participaçâo do sistema imune, que mediada por linfócitos T, quer por anticorpos e complemento. Igualmente, estudos de expressâo genômica nas lesôes de EM (a través da utilizçâo de gene microarrays) confirmaram a exitência de niveis de expressâo elevados de vârios genes clásicamente asociados à desposta imune, bem como a particpaçâo de novos genes de inflência até entâo insuspeita (4, 5). A encefalomielite autoimune experimental (EAE), o modelo animal de EM mais frecuentemente utilizado, tem sido ao longo dos últimos 70 anos uma das principias fontes de inspiraÇâo para comprender a fisiopatología desta doença (6). Com base neste modelo foi reconhecido o papel central da desposta imune adquirida, mediada através de linfócitos T autorreactivos conra componentes proteicos da mielina do SNC (7), como a proteína básica de mielina, glicoproteína oligodendrocítica da mielina, proteína proteolipídica e glicoproteína asociada à mielina (MBP, MOG, PLP e MAG, respectivamente). O papel da desposta linfocitária B contra antigénios do SNC nâo se encontra tâo bem definido, embora dados recentes provenientes do modelo de EAE e de estudos clínicos tenham confirmado a sua relevância na progressâo da doença e na determinaçâo da taxa de surtos (8, 9).

A identificaçâo dos alvos da desposta linfocitária B e T nos doentes com Esclerose Múltipla assume, dessa forma, uma grande importancia fisiopatológica, uma vez que permitiria nâo só elucidar alguns dos mecanismos subyacentes á origen da doença, mas também eventualmente levar ao desenvolvimento de terapêuticas antigénnio-específicas (10). No sangue periféricos de doentes com EM e em controles normais é possivel identificar linfócitos T reactivos contra vários componentes da bainha de mielina. Incluindo a MBP, MOG e PLP, e nos focos de desmielinizaçâo do CNS de doentes, o péptido imunodominante da MBP (MBP83-99) está asociado á molécula de HLA-DR2 expressa pelas células inflamatórias (11, 12). È igualmente possivel extrair anticorpos reactivos contra esta molécula das placas de desmielinizaçâo em doentes (13). A caracterizaçâo das desposta linfocitárias T contra antigénios de mielina, a partir de poluçôes linfocitárias periféricas, tem permitido identificar regiôes imunodominantes na MBP, MOG e PLP em doentes com EM, estudar o seu fenotipo T helper, restricçôes de repertorio e capacidade de produçâo de citoquinas (14-22). Com base nestes estudos, a pesar de nâo ter sido ainda possivel identificar antigénios que Sejas específicos para a induçâo da doença, ou relacionados com a evoluçâo clínica, foi já possivel confirmar a relaçâo entre a acapacidade de produçâo de citoquinas inflamatórias (como o interferçâo gama) e a progressâo clínica (23).

A proteína Nogo-A é um membro da familia de proteinas Reticulon recentemente identificado como sendo um dos mais importantes inibidores do recrescimento axonal presente exclusivamente na mielina do Sistema Nervoso Central (CNS) (24, 25). Existem três transcriptos alternativos do gene nogo, dos quais o Nogo-A é o mais longo de todos, contendo 1163 amino ácidos; todas as isoformas (Nogo-A, B e C) possuem um terminus carboxi comum, que contém uma sequência de 66 amino ácidos flanqueada por duas regiôes hidrofóbicas. A esta regiâo presumiblemente extracelular denominada Nogo-66, tem-se atribuido grande parte da capacidade de inibiçâo do crescimento neurítico desta protéina, mediada pela interacçâo com um recentemente identificado receptor presente em axónios (26, 27). A induçâo de despostas imunes contra algunas regiôes desta proteína tem sido alvo de diversos trabalhos, como o intuito de bloquear a sua acçâo, e, como tal, promover o recrescimiento axonal, sobretodo em modelos animais de trauma do CNS (28-31). Mais recentemente, nós e outros grupos temos estudado o possivel papel deste componente da mielijna na fisiopatogénese da EAE e da EM. Foi já possivel identificar anticorpos contra a proteína Nogo-A em doentes com EM, embora nâo tenha sido realizado o estudo de mapeamento de epítopos necesario para a identificaçâo dos residuos-chave para a desposta imune (32). A imunizaçâo activa contra a regiâo p472 desta proteína, e a transferencia adoptiva de imunoglobulinas anti-Nogo foram capazes de reducir a intensidade clínica, de desmielinizaçâo e perda axonal asociada à EAE (33). O nosso próprio trabalho demostrou que utilizando protocolos de induçâo de EAE destinados a quebrar tolerancia em estirpes sensivíveis à doença, a imunizaçâo com péptidos derivados da sequência extracelular Nogo-66 leva ao aparecimento de sinais clíicos e histopatológicos de desmielinizaçâo, bem como á geraçâo de uma desposta linfocitária T específica contra o antigéno utilizado na induçâo, e de anticorpos contra o antiénio indutor mas tambén contra vários outros antigénios de mielina, constituindo um ejemplo de diversificaçâo de epítopos (34, 35). Deste modo, algunas regiôes da proteína Nogo-A parecem ter a capacidade de agir como encefalitogénios capazes de inducir EAE, e juntamse á lista de alvos antigénicos potencialmente relevantes para a fisiopatología da EM. O facto desta proteína ser um dos mais importantes inibidores do recrescimento axonal assume tambén uma particular relevância, uma vez que a sua implicaçâo na desposta autoimune anti-mielina na EM poderia relacionar-se como os fenómenos de perda axonal progresiva, ou incapacidade de recuperaçâo após lesôes desmielinizantes agudas.

A presenta de linfócitos T reactivos contra antigénios de mielina em mpatologias traumáticas do SNC é um fenómeno igualmente bem conhecido (36, 37), sendo a sua geraçào probablemente dependente da pressencça nos locais de trauma de componentes celulares do Sistema Imune capazes de apresentar antigénios localmente libertados a células efectoras. O papel que estas células poderâo ter na fisiopatogénese e evoluçâo das lesôes traumáticos é pouco conhecido; existem vários dados provenientes de modelos experimentais de trauma, no en tanto, que parecem indicar que a resposta imunitária ao trauma, consistindo de células T reactivas contra componentes da mielina do SNC poderá ter um papel neuroprotector (38, 39). A presenta de linfócitos T reactivos contra antigénios Nogo, ou de anticorpos contra esta proteína poderia, neste ccontext, te ruma importância crucial na determinaçâo da resposata ao trauma, e na determinaçâo da incapacidade neurológica.

Composición del Jurado:

Prof. Dr. D. Carlos Penha Gonçalves, Dr. D. José Grilo, Prof. Dr. D. José Pereira Monteiro, Dr. D. Rui Pedrosa, Dr. D. Joaquím Pinheiro, Dra. Dª. Joâo Correira de Sá